Implikacje dla możliwych konsekwencji szczepionek przeciw COVID-19 – badanie !!!

Abstrakcyjny

1. Wstęp

Świat cierpi z powodu pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) wywołanej przez koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), pozytywnego wirusa o jednoniciowym RNA [ 1 , 2 ]. Do końca grudnia 2020 r. ponad 80 milionów ludzi zostało zarażonych SARS-CoV-2, powodując 1,8 miliona zgonów na całym świecie. SARS-CoV-2 wykorzystuje białko fuzyjne błony wirusowej, znane jako białko wypustek, do wiązania się z enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) jako „receptorem” w celu wniknięcia do ludzkich komórek gospodarza [ 3 , 4 ], powodując ciężkie zapalenie płuc i zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) [ 5]. Pacjenci w podeszłym wieku z chorobami układu krążenia są szczególnie podatni na rozwój poważnych chorób związanych z COVID-19, które w niektórych przypadkach prowadzą do śmierci, podczas gdy osoby młode i zdrowe są w dużej mierze odporne na rozwój ciężkich objawów [ 1 , 6 , 7 ]. Ponieważ COVID-19 nadal powoduje poważne problemy zdrowotne, ekonomiczne i socjologiczne, świat czeka na powszechne wprowadzenie skutecznych szczepionek, które mogą zakończyć tę pandemię.

Białko wypustek SARS-CoV-2, wirusowe białko fuzyjne klasy I, ma kluczowe znaczenie dla inicjowania interakcji między wirusem a receptorem powierzchniowym komórki gospodarza, ułatwiając wejście wirusa do komórki gospodarza poprzez pomoc w fuzji wirusa i komórki gospodarza membrany. Białko to składa się z dwóch podjednostek: podjednostki 1 (S1) zawierającej domenę wiążącą receptor ACE2 (RBD) i podjednostki 2 (S2), która odgrywa rolę w procesie fuzji [ 3 , 4 ] (Rysunek 1). Białko szczytowe SARS-CoV-2 jest głównym celem rozwoju szczepionek COVID-19.

2. Rozwój szczepionek przeciw COVID-19 na bazie białek kolczastych

Niezwykle szybki rozwój szczepionek i środków terapeutycznych na COVID-19 w 2020 roku był spowodowany efektywną współpracą między rządami a sektorem prywatnym. 9 listopada 2020 r. Pfizer i BioNTech ogłosiły, że ich kandydatka na szczepionkę opartą na mRNA, BNT162b2, jest skuteczna w ponad 90% na COVID-19 [ 8 ]. To była dobra wiadomość, ponieważ ujawniła, że ​​wkrótce mogą stać się dostępne skuteczne szczepionki. BNT162b2 koduje białko wypustek SARS-CoV-2 w celu wywołania przeciwciał neutralizujących wirusy [ 9 , 10]. Dokładniej, koduje pełnej długości białko wypustek SARS-CoV-2 z dwoma aminokwasami zmutowanymi do proliny w podjednostce S2 w celu utrzymania konformacji sprzed fuzji, podczas gdy jej siostrzana szczepionka BNT162b1 (również firmy Pfizer/BioNTech) koduje tylko RBD białka wypustkowego SARS-CoV-2, trimeryzowanego przez dodanie domeny foldonu fibrytyny T4 [ 9 , 10 , 11 ]. Badania kliniczne wykazały, że ani BNT162b1 [ 11 ], ani BNT162b12 [ 9 , 10 ] nie wykazują poważnych krótkotrwałych działań niepożądanych. 10 grudnia 2020 r. opublikowano wyniki dużego badania klinicznego BNT162b, wykazujące, że ta szczepionka zapewnia 95% ochronę u osób w wieku 16 lat lub starszych [ 12]]. Jednak długoterminowe konsekwencje tych szczepionek są nieznane.

Inna obiecująca szczepionka, mRNA-1273 firmy Moderna, jest również szczepionką RNA, która koduje białko wypustek SARS-CoV-2 o pełnej długości [ 13 ]. Szczepionki oparte na wektorach wirusowych, takie jak AZD1222 firmy AstraZeneca, która wykorzystuje niereplikujący się wektor adenowirusa szympansa [ 14 ], Ad26.COV2.S firmy Johnson & Johnson, system oparty na niereplikującym adenowirusie 26 [ 15 ] oraz Gam- COVID-Vac (Sputnik V) przez Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology [ 16 ], wszystkie wyrażają białko wypustek SARS-CoV-2. NVX-CoV2373 (Novavax), szczepionka na bazie rekombinowanego białka [ 17 ], jest również białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 pełnej długości. Te szczepionki, jak również wiele innych w trakcie opracowywania [ 18 , 19 ,20 ] wprowadzają do naszego organizmu białko szczytowe SARS-CoV-2, aby stymulować produkcję przeciwciał i odporność na SARS-CoV-2.

3. Białko kolce SARS-CoV-2 inicjuje sygnalizację komórkową w komórkach ludzkich

Stwierdzono, że traktowanie hodowanych pierwotnych ludzkich komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (SMC) lub komórek śródbłonka ludzkiej tętnicy płucnej zrekombinowaną podjednostką białka szczytowego S1 SARS-CoV-2 jest wystarczające do promowania sygnalizacji komórkowej bez pozostałych składników wirusowych [ 21 ]. Co więcej, nasza analiza pośmiertnych tkanek płuc pacjentów, którzy zmarli z powodu COVID-19, wykazała, że ​​pacjenci ci wykazywali pogrubienie ścian naczyń płucnych, cechę charakterystyczną tętniczego nadciśnienia płucnego (PAH) [ 21 ]. Na podstawie tych wyników zaproponowaliśmy, że białko wypustek SARS-CoV-2 (bez pozostałych składników wirusowych) wyzwala zdarzenia sygnalizacji komórkowej, które mogą sprzyjać przebudowie naczyń płucnych i PAH, a także prawdopodobnie innym powikłaniom sercowo-naczyniowym [ 21]., 22 ].

W naszych eksperymentach z hodowlą komórkową zbadano dwa rekombinowane białka wypustek SARS-CoV-2, z których oba zawierają RBD [ 21 ]. Pełnej długości podjednostka S1 zawiera większość podjednostki S1 (Val16-Gln690), podczas gdy podjednostka S1 RBD zawiera tylko region RBD (Arg319-Phe541), jak pokazano naRysunek 1. Hodowane pierwotne SMC ludzkiej tętnicy płucnej i komórki śródbłonka ludzkiej tętnicy płucnej traktowano tymi białkami przez 10 minut. Odkryliśmy, używając fosfospecyficznego przeciwciała MEK, że rekombinowana pełnej długości podjednostka S1 SARS-CoV-2 sama w stężeniu tak niskim jak 130 pM aktywowała MEK, aktywator pozakomórkowej kinazy regulowanej sygnałem (ERK) i dobrze znany mechanizm transdukcji sygnału dla wzrostu komórek [ 23 ]. W przeciwieństwie do tego, taka aktywacja sygnalizacji komórkowej przez białko wypustek nie wystąpiła w SMC tętnicy płucnej szczura [ 21 ].

Chociaż ACE2 jest obecnie dobrze znany jako „receptor”, z którym białko wypustkowe SARS-CoV-2 wiąże się z ludzkimi komórkami gospodarza w celu ułatwienia fuzji błon i uzyskania dostępu wirusa, zwykłą fizjologiczną funkcją ACE2 nie jest służenie jako receptor błonowy do przekazywania sygnałów wewnątrzkomórkowych. ACE2 jest integralnym białkiem błonowym typu I, które działa jako karboksypeptydaza, rozszczepiając angiotensynę II do angiotensyny (1–7) i regulując ciśnienie krwi [ 24 , 25 ] (Rysunek 2). Jednak dziesięć lat temu Chen i in. [ 26 ] przedstawili intrygujące odkrycia pokazujące, że ACE2 działa jako receptor błonowy do transdukcji sygnału komórkowego w odpowiedzi na białko wypustowe SARS-CoV (obecnie znanego również jako SARS-CoV-1, wirusa, który spowodował wybuch SARS w 2002 r.) 2004) w ludzkiej linii komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, A549. Białko wypustek SARS-CoV-1 jest 76–78% identyczne z SARS-CoV-2 [ 27 ]. W ich badaniach wykazano, że wiązanie pełnej długości białka wypustkowego z ACE2 wyzwala aktywację czynnika transkrypcyjnego aktywatora białka-1 (AP-1) zależną od kinazy kazeinowej II i późniejsze zdarzenia transkrypcyjne genów [ 26 ]. Ich odkrycie dotyczące SARS-CoV-1 [ 26 ] i nasze dotyczące SARS-CoV-2 [ 21] wskazują, że białko wypustek niezwykle funkcjonalnie przekształca ACE2 (czyli normalnie enzym peptydazę) w receptor błonowy do sygnalizacji komórkowej, która wykorzystuje białko wypustki jako ligand do jego aktywacji (Rysunek 2).

Kuba i in. [ 28 ] wykazali, że wstrzyknięcie myszom rekombinowanego białka wypustkowego SARS-CoV-1 zmniejszyło ekspresję ACE2 i pogorszyło wywołane kwasem uszkodzenie płuc. U myszy z uszkodzeniem płuc wywołanym kwasem, rekombinowane białko wypustek SARS-CoV-1 dramatycznie zwiększało poziom angiotensyny II, a inhibitor receptora angiotensyny, losartan, łagodził nasilenie uszkodzenia płuc wywołane przez białko wypustek [ 28 ]. Zatem te badania in vivo wykazały, że białko wypustek SARS-CoV-1 (bez reszty wirusa) zmniejsza ekspresję ACE2, zwiększa poziom angiotensyny II i zaostrza uszkodzenie płuc.

Wykazano, że białko wypustek SARS-CoV-2 bez pozostałych składników wirusowych aktywuje sygnalizację komórkową przez Patrę i in. [ 29 ]. Autorzy stwierdzili, że białko wypustek SARS-CoV-2 o pełnej długości, wyrażane za pomocą przejściowej transfekcji, w ludzkiej linii komórek nabłonka pęcherzyków płucnych A549 lub w ludzkiej linii komórek nabłonka wątroby Huh7.5, aktywowało NF-κB i Czynniki transkrypcyjne AP-1 oraz kinazy białkowe aktywowane mitogenami p38 i ERK, uwalniające interleukinę-6. Stwierdzono, że ta kaskada sygnalizacji komórkowej jest wyzwalana przez białko wypustkowe SARS-CoV-2, które reguluje w dół ekspresję białka ACE2, a następnie aktywuje receptor angiotensyny II typu 1 [ 29]]. Te eksperymenty z przejściową transfekcją mogą odzwierciedlać wewnątrzkomórkowe efekty białka wypustek, które mogą być wywołane przez szczepionki oparte na RNA i wektorach wirusowych.

Wyniki te wspólnie wzmacniają ideę, że komórki ludzkie są wrażliwe na zewnątrzkomórkowe i/lub wewnątrzkomórkowe białka kolców poprzez aktywację transdukcji sygnału komórkowego.

4. Nadciśnienie płucne

PAH to poważna, nieuleczalna choroba, która może dotknąć mężczyzn i kobiety w każdym wieku, w tym dzieci. Podwyższony opór naczyniowy płuc w PAH powoduje niewydolność prawokomorową, a następnie zgon. Pacjenci, u których zdiagnozowano PAH, nie leczeni żyją średnio tylko 2–3 lata od momentu rozpoznania [ 30 , 31 ]. Nawet przy obecnie dostępnych terapiach tylko 60–70% pacjentów z PAH przeżywa trzy lata [ 32 , 33 , 34 , 35 ]. PAH jest trudne do wykrycia, ponieważ jego objawy (np. duszność, zmęczenie i zawroty głowy) są podobne do innych powszechnych stanów nie zagrażających życiu, a oficjalna diagnoza PAH musi zostać postawiona poprzez inwazyjne cewnikowanie prawego serca [36 ]. Dysfunkcja śródbłonka jest częstą cechą pacjentów z PAH i COVID-19 [ 37 , 38 ].

„Wybuchy” PAH pojawiły się w związku z narażeniem na niektóre leki lub toksyny [ 39 ]. Główny wybuch PAH miał miejsce w 1965 roku i był związany z aminoreksem, lekiem stymulującym utratę wagi [ 39 , 40 ]. Około 0,2% osób przyjmujących ten lek rozwinęło PAH [ 40 ]. Epidemia została zaobserwowana dwa lata po wprowadzeniu aminoreksu, a połowa pacjentów zmarła 10 lat po epidemii [ 39 ].

Badaliśmy naczynia płucne pacjentów z COVID-19 oraz pacjentów zakażonych wirusem H1N1, którzy zmarli z powodu ARDS [ 21 ]. Tętnice płucne pośmiertnych płuc pacjentów z COVID-19 konsekwentnie wykazywały histologiczne cechy pogrubienia ścian naczyń, głównie z powodu przerostu osłonki środkowej. Szczegółowa analiza patologiczna wykazała utratę przejrzystości granic między naczyniami a otaczającym miąższem płuc, powiększenie SMC środkowej wyściółki tętnic, obrzęk jąder SMC oraz utworzenie wakuoli w cytoplazmie SMC [ 21].]. Analiza morfometryczna wykazała, że ​​mediana grubości ścian naczyń płucnych wynosiła 15,4 μm dla pacjentów z COVID-19 i 6,7 μm dla pacjentów z grypą i wartości te różniły się istotnie od siebie [ 21 ]. Pogrubienie ścian naczyń płucnych u pacjentów z COVID-19 obserwowano również w tomografii komputerowej klatki piersiowej [ 41 , 42 ]. Zatem te wyniki łącznie wskazują, że COVID-19 jest związany z pogrubieniem ścian naczyń płucnych. Badania, czy to pogrubienie ścian naczyń płucnych jest związane z klinicznie istotnym PAH i rolą białka wypustek w patogenezie PAH, są uzasadnione.

5. Białko szczytowe SARS-CoV-2 zawierające tylko RBD nie wywołuje sygnalizacji komórkowej w komórkach ludzkich

W przeciwieństwie do pełnej długości białka wypustek [ 26 , 29 ] lub pełnej długości podjednostki SARS-CoV-2 białka wypustek S1 [ 21 ], stwierdziliśmy, że białko zawierające tylko RBD (Rysunek 1) nie promowały sygnalizacji komórkowej. Nasze wyniki analizy Western blot monitorujące aktywację MEK wykazały, że średnie wartości stosunku ± SEM fosforylowanego białka MEK do MEK wynosiły 0,05 ± 0,003 (nieleczone), 1,9 ± 0,07 (leczone białkiem S1 o pełnej długości) i 0,05 ± 0,003 (leczone białko zawierające tylko RBD) dla ludzkich SMC tętnicy płucnej; i 0,09 ± 0,006 (nieleczony), 0,90 ± 0,06 (leczony pełnej długości białkiem S1) i 0,10 ± 0,003 (leczony tylko białkiem zawierającym RBD) dla ludzkich komórek śródbłonka tętnicy płucnej [ 21 ].

Różne efekty pełnej długości białek zawierających tylko S1 i RBD mogą być ważne, biorąc pod uwagę, że BNT162b2 i wiele innych szczepionek COVID-19 wyraża pełnej długości białko wypustek, podczas gdy szczepionka BNT162b1 koduje tylko region RBD [ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ]. Opracowywane są również inne szczepionki przeciw COVID-19 na bazie RBD [ 43]. Możliwe, że szczepionki oparte na RBD są mniej immunogenne, ale mogą nie wpływać na komórki gospodarza. W związku z tym mogą być mniej ryzykowne, biorąc pod uwagę potencjalne długoterminowe negatywne skutki. Jednak w badaniu in vivo białka wypustkowego SARS-CoV-1 opisanego powyżej [ 28 ] mutant delecyjny, który zawierał tylko RBD, również pogorszył wywołaną kwasem niewydolność płuc, podobnie jak białko wypustkowe o pełnej długości. W związku z tym potrzebne są dalsze prace, aby zrozumieć wpływ pełnej długości białka wypustek i białka zawierającego wyłącznie RBD na różne procesy biologiczne.

6. Dyskusja

Ogólnie uważa się, że jedyną funkcją białek fuzyjnych błon wirusowych jest umożliwienie wirusom wiązania się z komórkami gospodarza w celu wniknięcia wirusa do komórek, dzięki czemu materiał genetyczny może zostać uwolniony, a replikacja i amplifikacja wirusa może trwać miejsce. Jednak ostatnie obserwacje sugerują, że białko szczytowe SARS-CoV-2 może samo z siebie wyzwalać sygnalizację komórkową, która może prowadzić do różnych procesów biologicznych. Rozsądne jest założenie, że takie zdarzenia w niektórych przypadkach powodują patogenezę niektórych chorób.

Nasze laboratorium testowało jedynie działanie białka wypustkowego SARS-CoV-2 w komórkach naczyń płucnych i tych, które biorą udział w rozwoju PAH. Jednak białko to może również wpływać na komórki naczyń układowych i wieńcowych, wywołując inne choroby sercowo-naczyniowe, takie jak choroba wieńcowa, nadciśnienie układowe i udar. Oprócz komórek sercowo-naczyniowych, inne komórki, w których zachodzi ekspresja ACE2, mogą być dotknięte przez białko wypustek SARS-CoV-2, co może powodować niekorzystne zdarzenia patologiczne. Dlatego ważne jest rozważenie możliwości, że białko szczytowe SARS-CoV-2 wytwarzane przez nowe szczepionki COVID-19 wyzwala zdarzenia sygnalizacji komórkowej, które promują PAH, inne powikłania sercowo-naczyniowe i/lub powikłania w innych tkankach/narządach u niektórych osób (Rycina 3). Będziemy musieli uważnie monitorować długoterminowe konsekwencje szczepionek COVID-19, które wprowadzają białko kolce do ludzkiego ciała. Ponadto, chociaż dane dotyczące ludzi na temat możliwych długoterminowych konsekwencji szczepionek COVID-19 opartych na białku kolczastym nie będą wkrótce dostępne, konieczne jest jak najszybsze zastosowanie odpowiednich eksperymentalnych modeli zwierzęcych, aby zapewnić, że SARS-CoV-2 białko kolczaste nie wywołuje żadnych oznak patogenezy TNP ani żadnych innych przewlekłych stanów patologicznych.

7. Wnioski

Podsumowując, niedawne postępy w opracowywaniu szczepionki przeciw COVID-19 opartej na białku szczytowym SARS-CoV-2 są ekscytujące i rzuciły światło na to, jak zakończyć obecną pandemię. Te szczepionki powinny przynosić korzyści osobom starszym z chorobami podstawowymi, jeśli nie wykazują żadnych ostrych działań niepożądanych. Musimy jednak dokładnie rozważyć ich długoterminowe konsekwencje, zwłaszcza gdy są podawane zdrowym osobom, a także młodym dorosłym i dzieciom. Oprócz oceny danych, które staną się dostępne od osób zakażonych SARS-CoV-2, a także tych, które otrzymały szczepionki oparte na białku wypustek, dalsze badania wpływu białka wypustek SARS-CoV-2 na komórki ludzkie i odpowiednie zwierzęta modele są objęte gwarancją.

Autorskie Wkłady

Konceptualizacja, YJS; walidacja, YJS i SGG; dochodzenie, YJS i SGG; zasoby, YJS i SGG; pisanie – przygotowanie oryginalnego projektu, YJS; pisanie – recenzja i redakcja, YJS i SGG; wizualizacja, YJS; nadzór, YJS; administracja projektami, YJS; pozyskanie finansowania, YJS Obaj autorzy przeczytali i zgodzili się na opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie

Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez National Institutes of Health (NIH), grant o numerach R21AI142649, R03AG059554 i R03AA026516, ze środków przyznanych YJS. Za treść odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w piśmie rękopisu; lub w decyzji o opublikowaniu wyników.

Bibliografia