Ambroksol Hasco Junior

Ambroksol – Kolejny lek za 8 PLN z każdej polskiej apteki bez ! recepty może ratować życie Polaków !

Ale czy kogoś to interesuje ?

Hamowanie kwaśnej sfingomielinazy przez Ambroksol zapobiega wnikaniu SARS-CoV-2 do komórek nabłonka.


Nie interesuje lekarzy, Nie interesuje pseudo profesorów z rady medycznej , Nie interesuje dziennikarzy z przekupionych mediów i w końcu NIE interesuje Polaków, którzy dali się bezkrytycznie zmanipulować i tłumnie poszli wyszczepić w majowy weekend. 

 

Ambroksol – na skróty – od razu wnioski z badania

Niniejsze badania pokazują, że ambroksol zapobiega przedostawaniu się piku pp-VSV-SARS-CoV-2 do hodowanych komórek nabłonka, a także świeżo izolowanych ludzkich komórek nabłonka nosa ex vivo ( ryc. 7 ).

Ambroksol – Co najważniejsze, inhalacja ambroksolu była wystarczająca, aby zmniejszyć aktywność kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo i zapobiec infekcji pp-VSV-SARS-CoV-2 komórek nabłonka nosa ex vivo . W eksperymentach inhalacyjnych wykorzystano standardowe stężenia ambroksolu, które są również stosowane w leczeniu pacjentów. Stężenia te były wystarczające do zmniejszenia aktywności kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo, jak pokazano tutaj. Zatem stężenia stosowane klinicznie powinny być wystarczające, aby zapobiec zakażeniu pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2.

Wdychaliśmy około 20 mM roztwór ambroksolu. Ponieważ 20-25 μM ambroksolu wystarcza do zablokowania zakażenia pp-VSV-SARS-CoV-2, spodziewamy się bardzo szerokiego okna terapeutycznego.

 

Hamowanie kwaśnej sfingomielinazy przez Ambroksol zapobiega wnikaniu SARS-CoV-2 do komórek nabłonka.

Ryc.7 . Schemat proponowanego hamowania zakażeń kolcem pp-SARS-CoV-2 przez ambroksol. Początkowe wiązanie piku pp-VSV-SARS-CoV-2 powoduje aktywację kwaśnej sfingomielinazy, tworzenie ceramidów powierzchniowych i tworzenie platform membranowych wzbogaconych w ceramidy, które służą do pułapkowania i skupiania aktywowanych receptorów ACE2. Gromadzenie się ACE2 w platformach membranowych wzbogaconych ceramidami może ułatwić przekazywanie sygnałów przez ten receptor, ostatecznie prowadząc do internalizacji, ale także zbliżyć wirusa do proteaz wymaganych do wychwytu.

My i inni wykazaliśmy, że ceramid często sprzyja infekcjom bakteryjnym i wirusowym ( 24 , 25 , 26 , 27 ). Ceramid zmienia błonę plazmatyczną i indukuje tworzenie dużych platform membranowych wzbogaconych ceramidami, które służą do pułapkowania i skupiania cząsteczek receptorów i związanych z nimi sygnałosomów ( 7). W tym miejscu przedstawiamy dowody na to, że skupiska ACE2 w domenach błonowych wzbogaconych w ceramidy po zaszczepieniu komórek pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 potwierdzają pogląd, że ACE2 musi zostać ponownie zorganizowany w te domeny, aby pośredniczyć w zakażeniu. Możliwe jest również, że platformy membranowe wzbogacone ceramidami są wymagane do aktywacji TMPRSS2 i / lub katepsyny L, które pośredniczą w obróbce kolca wymaganego do fuzji z błoną komórkową ( 28 , 29 ).

 

Całe badanie – tłumaczenie maszynowe bez korekty – Oryginała tutaj

Hamowanie kwaśnej sfingomielinazy przez ambroksol zapobiega wnikaniu SARS-CoV-2 do komórek nabłonka

Wykazano, że układ kwaśnej sfingomielinazy / ceramidów jest ważny dla zakażeń komórkowych przynajmniej niektórymi wirusami, na przykład rinowirusami lub SARS-CoV-2. Funkcjonalne hamowanie kwaśnej sfingomielinazy przy użyciu trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych zapobiegało infekcjom komórek nabłonka, na przykład SARS-CoV-2. Struktura ambroksolu, tj. Trans-4 – [(2,4-dibromanilin-6-ylo) -metyloamino] -cykloheksanolu, leku mukolitycznego stosowanego wziewnie, sugeruje, że lek ten może hamować kwaśną sfingomielinazę, a tym samym zakażenie SARS -CoV-2. Aby to przetestować, użyliśmy pseudotypowych cząstek wirusa białek wypustek (spike pp-VSV-SARS-CoV-2), prawdziwiesystem naśladujący wejście SARS-CoV-2 do komórek. Wirusowy wychwyt i tworzenie lokalizacji ceramidów określono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aktywność kwaśnej sfingomielinazy przez spożycie [14C] sfingomielinę i ceramid oznaczono ilościowo metodą kinazy. Okazało się, że wejście piku pp-VSV-SARS-CoV-2 wymagało aktywacji kwaśnej sfingomielinazy i uwolnienia ceramidu, a wszystkim tym zdarzeniom zapobiegało wstępne traktowanie ambroksolem. Uzyskaliśmy również komórki nabłonka nosa od ochotników przed i po inhalacji ambroksolu. Wdychanie ambroksolu zmniejszyło aktywność kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosasi zapobiegał aktywacji kwaśnej sfingomielinazy indukowanej przez pp-VSV-SARS-CoV-2, uwalnianiu ceramidu i wejściu piku pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo. Dodanie oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy lub ceramidu C16 przywróciło wejście ostrza pp-VSV-SARS-CoV-2 do komórek nabłonka traktowanych ambroksolem. Proponujemy, że ambroksol może być odpowiedni do badań klinicznych w celu zapobiegania COVID-19.

Wdychanie wodoru H2 łagodzi i leczy uszkodzenie płuc wywołane respiratorem

Wprowadzenie

Zakażenia z ciężkim ostrym zespołem oddechowym koronawirus-2 (SARS-CoV-2) jest odpowiedzialny za pandemię choroby koronawirusa 2019 (COVID-19), ogromny globalny problem zdrowotny. Wielu zakażonych pacjentów wykazuje łagodne objawy, ale u znacznej liczby pacjentów, zwłaszcza starszych i z dodatkowymi czynnikami ryzyka, rozwija się ciężka choroba ( 1 ). Ciężki COVID-19 wymaga intensywnej opieki i leczenia respiratorowego i wiąże się z wysoką śmiertelnością ( 1 ). Wiek, wysokie ciśnienie krwi lub nadwaga są czynnikami ryzyka wystąpienia ciężkiego COVID-19, ale nawet u zdrowych i młodych osób rozwija się ciężka choroba ( 2 ). Dlatego niezwykle interesujące jest opracowanie solidnych możliwości profilaktyki i leczenia.

Białko SARS-CoV-2 jest wbudowywane w otoczkę wirusa i pośredniczy w wnikaniu wirusa do komórek docelowych. W tym celu jednostka powierzchniowa S1 kolca SARS-CoV-2 wiąże się z komórkowym receptorem enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) ( 3 , 4 , 5 ), a podjednostka S2 łączy błonę wirusową z docelową błoną komórkową. Strukturalne wymagania dotyczące interakcji białka wypustek z ACE2 są dobrze scharakteryzowane ( 3 , 4 , 5 ). Jednak rola lipidów błonowych we wnikaniu wirusów wymaga zdefiniowania.

Sfingolipidy są nie tylko składnikami strukturalnymi błon komórkowych i określają ich właściwości biofizyczne, ale biorą również udział w transdukcji sygnałów komórkowych, regulacji proliferacji i różnicowania, apoptozy, przemieszczaniu się błon i organizacji białek w błonach ( 6 , 7 , 8 , 9 , 10 ). Tutaj skupiliśmy się na roli kwaśnej sfingomielinazy (EC 3.1.4.12, fosfodiesteraza sfingomieliny), enzymu lizosomalnego, który przekształca sfingomielinę w ceramid, w zakażeniu komórkowym SARS-CoV-2. Enzym jest obecny w lizosomach i kwaśnych domenach błony komórkowej po fuzji wydzielniczych lizosomów z błoną plazmatyczną ( 10 ,11 ). Aktywność kwaśnej sfingomielinazy powoduje uwalnianie ceramidu ze sfingomieliny i, jeśli ceramid jest uwalniany na powierzchni komórki, tworzenie domen błonowych wzbogaconych w ceramidy w zewnętrznym płatku błony komórkowej ( 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ). Bardzo hydrofobowe cząsteczki ceramidów łączą się ze sobą, tworząc spontanicznie odrębne domeny błonowe. Te wzbogacone w ceramidy domeny membranowe łączą się w duże, silnie hydrofobowe, ciasno upakowane, żelopodobne platformy membranowe wzbogacone ceramidami ( 10 , 11 ). Platformy te służą do klastrowania cząsteczek receptorów oraz organizowania, pułapkowania i koncentracji określonych cząsteczek sygnałowych (10 , 11 , 12 , 13 ).

Wcześniej wykazaliśmy ważną rolę systemu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidu w zakażeniach SARS-CoV-2 ( 14 ). Wykazaliśmy, że zakażenie wyhodowanych komórek nabłonka lub świeżo wyizolowanych ludzkich komórek nabłonka nosa odpowiednio SARS-CoV-2 lub pseudowirusem pp-VSV-SARS-CoV-2 spowodowało aktywację kwaśnej sfingomielinazy i uwolnienie ceramidu ( 14 ). Genetyczne lub farmakologiczne hamowanie kwaśnej sfingomielinazy oraz zużycie lub neutralizacja ceramidu na powierzchni komórki zapobiegały zakażeniu komórek nabłonka SARS-CoV-2 ( 14 ).

Kilka leków funkcjonalnie hamuje kwaśną sfingomielinazę ( 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 ). Strukturalne wymagania do hamowania to lipofilowy pierścień organiczny, który integruje się z błonami lizosomalnymi, krótki odstępnik i naładowana trzeciorzędowa grupa aminowa, która wypiera kwaśną sfingomielinazę z błon lizosomalnych, uwalniając w ten sposób enzym do światła lizosomu i powodując jego częściową degradację. Wiele leków przeciwdepresyjnych jest funkcjonalnymi inhibitorami kwaśnej sfingomielinazy ( 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 2021 ). Zaproponowaliśmy akronim FIASMA (Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse) dla związku z tej dużej grupy leków o tych właściwościach ( 21 ).

Tutaj sprawdziliśmy, czy ambroksol, tj. Trans-4 – [(2,4-dibromanilin-6-ylo) -metyloamino] -cykloheksanol, lek, który spełnia powyższe wymagania strukturalne, hamuje kwaśną sfingomielinazę i dlatego może być ponownie mające na celu zahamowanie infekcji SARS-CoV-2. Ambroksol zawiera lipofilowy organiczny układ pierścieniowy, który jest połączony z trzeciorzędową aminą przez krótki odstępnik, a zatem jest potencjalnym funkcjonalnym inhibitorem kwaśnej sfingomielinazy. Ambroksol to lek mukolityczny stosowany w leczeniu schorzeń górnych i dolnych dróg oddechowych. Nie ma prawie żadnych skutków ubocznych.

Jako system infekcyjny wykorzystaliśmy cząsteczki pseudowirusowe wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) z niedoborem replikacji (pp-VSV) prezentujące na powierzchni wypustki białka SARS-CoV-2, w skrócie pp-VSV-SARS-CoV-2 ( 22 ). Kilka wcześniejszych badań wykazało, że cząstki te dokładnie odzwierciedlają kluczowe aspekty wnikania koronawirusa do komórek gospodarza ( 14 , 22 ).

Pokazujemy, że wejście piku pp-VSV-SARS-CoV-2 do hodowanych komórek nabłonka lub świeżo wyizolowanych komórek nabłonka nosa powoduje aktywację kwaśnej sfingomielinazy i uwolnienie ceramidu. Zdarzenia te zostały zablokowane przez wstępne leczenie małymi dawkami ambroksolu. Zgodnie z tym ambroksol zapobiegał przenikaniu do komórek piku pp-VSV-SARS-CoV-2. Co ważniejsze, uzyskaliśmy komórki nabłonka nosa od ochotników przed i po inhalacji ambroksolem i zainfekowaliśmy komórki kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2. Te eksperymenty in vivo / ex vivo wykazały, że wdychanie ambroksolu jest wystarczające do zmniejszenia aktywności kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo i do zapobiegania zakażeniu pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo.. Dodanie oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy lub ceramidu C16 przywróciło infekcję komórek nabłonka nosa traktowanych ambroksolem z kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2.

Inhalacja wodoru H2 cząsteczkowego w leczeniu zakażenie wirusem COVID-19

Wyniki

Aby sprawdzić, czy ambroksol hamuje kwaśną sfingomielinazę, inkubowaliśmy komórki nabłonka Vero-E6 ze wzrastającymi dawkami ambroksolu i określiliśmy aktywność kwaśnej sfingomielinazy w lizatach komórkowych. Ambroksol indukował zależne od dawki zmniejszenie aktywności kwaśnej sfingomielinazy w komórkach Vero-E6 ( ryc. 1 A). Ambroksol nie wykazywał toksyczności aż do stężenia 50 μM, podczas gdy wyższe stężenia, takie jak 75 μM, zaczęły wykazywać pewną toksyczność, o czym świadczą badania cytometrii przepływowej komórek nietraktowanych i traktowanych ambroksolem barwionych FITC-Annexin V ( ryc. 1 B).

Hamowanie kwaśnej sfingomielinazy przez Ambroksol zapobiega wnikaniu SARS-CoV-2 do komórek nabłonka.

Ryc.1 . Ambroksol zmniejsza aktywność kwaśnej sfingomielinazy. ( A ) Komórki Vero-E6 inkubowano z 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 lub 75 µM ambroksolu lub z rozpuszczalnikiem (0) przez 60 minut. Komórki poddano lizie w 250 mM octanie sodu (pH 5,0) i 0,2% NP40, a aktywność kwaśnej sfingomielinazy oznaczono mierząc zużycie dodanej [ 14 C] sfingomieliny. Dla łatwiejszego określenia ilościowego podano procentowy spadek aktywności kwaśnej sfingomielinazy. Przedstawiono średnie ± SD aktywności kwaśnej sfingomielinazy z 6 niezależnych eksperymentów. * p <0,05, *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . ( B.) Ambroksol nie wykazywał cytotoksyczności po leczeniu przez 24 godziny. Komórki wystawiano na 24 godziny na 1, 10, 25, 50 lub 75 µM ambroksolu, a toksyczność mierzono za pomocą barwienia FITC-Annexin V. Barwienie FITC-aneksyna V analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Permeabilizowane komórki służyły jako kontrola pozytywna w barwieniu FITC-aneksyna V. Przedstawiono średnie ± SD fluorescencji (w jednostkach arbitralnych) w badaniach cytometrii przepływowej (n = 4); ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . Wyniki prezentowane są w dowolnych jednostkach (au).

Następnie zbadaliśmy, czy impuls pp-VSV-SARS-CoV-2 indukuje aktywację kwaśnej sfingomielinazy w komórkach Vero-E6 i czy temu wzrostowi zapobiega się poprzez wstępne traktowanie komórek ambroksolem. Infekcja komórek pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 spowodowała szybką aktywację kwaśnej sfingomielinazy, która osiągnęła szczyt 30 minut po zakażeniu ( ryc. 2 A), zgodnie z wcześniej opisanymi danymi ( 14 ). Wzrostowi aktywności kwaśnej sfingomielinazy po zakażeniu kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 zapobiegano przez preinkubację z ambroksolem ( ryc. 2 A). Ambroksol nie miał wpływu na aktywność kwaśnej ceramidazy (nie pokazano).

Ryc.2 . Ambroksol zapobiega aktywacji kwaśnej sfingomielinazy i uwalnianiu ceramidu po zakażeniu kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2. ( A ) Komórki Vero-E6 wstępnie inkubowano z 25 µM ambroksolem przez 60 minut lub pozostawiono bez traktowania. Komórki zakażono pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 we wskazanym czasie lub pozostawiono niezainfekowane (0). Komórki poddano lizie w 250 mM octanie sodu (pH 5,0) i 0,2% NP40, a aktywność kwaśnej sfingomielinazy oznaczono mierząc zużycie dodanej [ 14 C] sfingomieliny. Przedstawiono średnie ± SD aktywności kwaśnej sfingomielinazy z 6 niezależnych eksperymentów. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, ANOVA, a następnie post hoc t Studenta-testy. Symbole zamknięte podają przebieg czasu bez ambroksolu, symbole otwarte – przebieg czasu z 25 µM ambroksolu. ( B ) Komórki traktowano 10, 20 lub 25 μM ambroksolu przez 1 godzinę i zakażano igłą pp-SARS-CoV-2 przez 30 minut lub pozostawiano nieleczone lub niezakażone, przemywano i ekstrahowano organicznie w celu oznaczenia ilościowego ceramidu C16 / C18, C22 / Poziomy ceramidu C24 metodą kinazy ceramidowej. Wyświetlane są średnie ± SD stężeń ceramidów z każdych 6 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc , jak wskazano lub porównane z odpowiednią wartością bez inhibitora. Szare symbole przedstawiają ceramidy 16 / C18, czarne symbole przedstawiają ceramidy C22 / 24.

Wcześniej wykazaliśmy, że inkubacja komórek nabłonka z kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 wyzwala uwalnianie ceramidu, który jest niezbędny do zakażenia komórek wirusem ( 14 ). Tutaj potwierdzamy te dane i pokazujemy, że zakażenie komórek Vero pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 powoduje uwolnienie ceramidu C16 / C18, jak również ceramidu C22 / C24 ( ryc. 2 B). Uwalnianiu ceramidu po zakażeniu zapobiega wstępne leczenie ambroksolem ( ryc. 2 B). Zaobserwowaliśmy całkowite zahamowanie tworzenia ceramidów wywołanych infekcją przy 25 μM, ale już stężenia 15-20 μM ambroksolu zmniejszyły lub prawie zniosły tworzenie ceramidów po zakażeniu ( ryc. 2 B). Ambroksol nie zmieniał podstawowych stężeń ceramidów w komórkach.

Wcześniej wykazaliśmy, że cząsteczki ceramidu tworzą duże domeny błonowe wzbogacone w ceramidy, które służą do pułapkowania i klastrowania cząsteczek receptorów, ułatwiając w ten sposób przekazywanie sygnałów przez te receptory ( 10 ). Tutaj pokazujemy, że zakażenie komórek Vero-E6 pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 skutkuje utworzeniem domen błonowych wzbogaconych w ceramidy, które skupiają ACE2 ( ryc. 3 A, B), co sugeruje, że służą one jako platformy aby umożliwić zakażenie komórek.

Ryc.3 . Klastry ACE2 w domenach błon wzbogaconych ceramidami po zakażeniu. ( A, B ) Zakażenie komórek Vero-E6 pp-VSV-SARS-CoV-2 skutkuje utworzeniem domen błonowych wzbogaconych w ceramidy, które skupiają ACE2, czemu zapobiega traktowanie ambroksolem. Komórki zakażano przez 30 minut, utrwalano, barwiono przeciwciałami anty-ceramidowymi i FITC-anty-ACE2 sprzężonymi z Cy3 i analizowano pod mikroskopem konfokalnym. Panel A przedstawia przegląd w małym powiększeniu, aby uwidocznić obfitość domen błonowych wzbogaconych w ceramidy, skupiających ACE2. Panel B przedstawia większe powiększenie zainfekowanych komórek. Należy pamiętać, że infekcja nie tylko indukuje ceramid, ale także zwiększa powierzchniową ekspresję ACE2 ( 14). Przedstawiono reprezentatywny wynik 6 niezależnych eksperymentów.

Wcześniej wykazaliśmy, że sfingozyna hamuje również zakażenie ludzkich komórek SARS-CoV-2 ( 23 ). Dlatego zbadaliśmy, czy ambroksol zmienia stężenia sfingozyny w komórkach. Wyniki pokazują, że nawet wysokie stężenia ambroksolu nie zmieniają sfingozyny komórkowej (nie pokazano).

Blokada aktywacji kwaśnej sfingomielinazy i uwalniania ceramidu przez ambroksol zależna od impulsu pp-VSV-SARS-CoV-2 zachęciła nas do zbadania, czy ambroksol również hamuje wejście piku pp-VSV-SARS-CoV-2. Komórki Vero-E6 wstępnie traktowano ambroksolem przez 60 minut, przemywano, a następnie infekowano pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 60 minut. Wyniki wskazują, że 10 µM lub 15-20 µM ambroksolu zmniejszyło wnikanie wirusa odpowiednio o około 50% lub 80-90%, a 25 µM ambroksolu całkowicie zablokowało wejście ( ryc. 4 A i 4B). Zakażenie wyższymi stężeniami skoku VSV-SARS-CoV-2 było również blokowane przez ambroksol ( ryc. 4 B). Dodanie oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy, która wytwarza endogenny ceramid lub 10 μM egzogennego ceramidu C16, przywracający wniknięcie wirusa ( ryc.4.A) wskazując, że ambroksol działał poprzez hamowanie kwaśnej sfingomielinazy i uwalnianie ceramidu. Natomiast dodanie sfingomieliny nie zmieniło infekcji pp-SARS-CoV-2 ( ryc. 4 B). Następnie zneutralizowaliśmy ceramid 2 różnymi przeciwciałami przeciw ceramidom lub przez inkubację z ceramidazą i wykazaliśmy, że te terapie również zapobiegają wychwytowi wirusa ( ryc. 4 B).

Ryc.4 . Ambroksol zapobiega zakażeniu SARS-CoV-2. ( A.) Komórki Vero-E6 wstępnie traktowano 10 µM lub 25 µM ambroksolem przez 1 godzinę lub pozostawiono nietraktowane i zakażono kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 lub pp-VSV-G przez 24 godziny. Infekcję mierzono na podstawie ekspresji eGFP w komórkach. Ambroksol blokował infekcję komórek pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 (symbole zamknięte), ale nie miał wpływu na zakażenie pp-VSV-G (symbole otwarte). Rekonstytucja ceramidu w komórkach Vero, które zostały potraktowane 25 μM ambroksolem przez dodanie 10 μM ceramidu C16 lub 0,2 U / ml kwaśnej sfingomielinazy (ASM) przywróciło zakażenie komórek pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2. Przedstawiono średnie ± SD odsetka zakażonych komórek z 6 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . ( B.) Wyższe stężenia piku pp-VSV-SARS-CoV-2 skutkują wyższym odsetkiem zakażonych komórek, ale nie zmieniają zdolności ambroksolu do zależnego od dawki hamowania infekcji komórek Vero-E6. Neutralizacja ceramidu powierzchniowego dwoma różnymi przeciwciałami przeciw ceramidom, tj. Monoklonalnym przeciwciałem IgM i przeciwciałem IgG, lub leczenie ceramidazą również zapobiegało zakażeniu kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2. Dodanie sfingomieliny (50 µM) nie miało wpływu na infekcję. Podano średnie ± SD odsetka zakażonych komórek z 6 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . Czarne symbole oznaczają komórki nietraktowane i traktowane ambroksolem, szare symbole oznaczają komórki odtworzone z przeciwciałami przeciw ceramidom lub sfingomieliną. ( C.) Leczenie komórek Caco-2 ambroksolem w sposób zależny od dawki, zapobiegającym zakażeniu pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2. Podobnie transfekcja komórek Caco-2 shRNA ukierunkowana na kwaśną sfingomielinazę zapobiegała infekcji, podczas gdy kontrolne shRNA nie miało wpływu na infekcję. Dodanie ambroksolu do komórek transfekowanych kwaśną sfingomielinazą celującą w shRNA nie przyniosło dodatkowych efektów. Wyświetlane są średnie ± SD procentu zakażonych komórek z 6 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . Symbole zamknięte to komórki nietransfekowane, symbole otwarte reprezentują komórki transfekowane.

Leczenie komórek Caco-2 z ambroksol lub genetycznego do regulacji w dół do sfingomielinazy kwasowego w komórki Caco-2 skutkuje również hamowanie PP-VSV-SARS CoV-2 wychwytu, co zostało przez C16 ceramidu ( fig. 4 C ). Dodanie ambroksolu do komórek regulowanych w dół kwaśnej sfingo-mielinazy potraktowanych ceramidem C16 nie wpłynęło dalej na wychwyt wirusa, potwierdzając pogląd, że ambroksol działa specyficznie, celując w kwaśną sfingomielinazę.

Kontrole z pp-VSV-G, które nie aktywują układu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidów i nie stosują tego systemu do infekcji komórkowych, jak pokazano wcześniej ( 14 ), wykazały, że wejście pp-VSV-G nie było modulowane przez ambroksol ( ryc. 4 A), co wskazuje, że ambroksol specyficznie blokuje wejście piku pp-VSV-SARS-CoV-2 poprzez hamowanie układu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidu.

Następnie zbadaliśmy, czy nasze odkrycia dokonane na linii komórkowej są powtórzone z pierwotnymi ludzkimi komórkami nabłonka oddechowego. W tym celu wyizolowaliśmy komórki nabłonka nosa od ochotników, potraktowaliśmy je 25 µM ambroksolem przez 60 minut lub pozostawiliśmy komórki bez leczenia i określiliśmy aktywność kwaśnej sfingomielinazy i zakażenie komórek. Ambroksol zmniejszał aktywność kwaśnej sfingomielinazy w niezainfekowanych komórkach o około 50% i zapobiegał stymulacji kwaśnej sfingomielinazy po ekspozycji na pp-VSV-SARS-CoV-2 ( ryc. 5 A). Ambroksol zablokował wejście piku pp-VSV-SARS-CoV-2 do świeżo wyizolowanych komórek nabłonka nosa z ( ryc.B) i dodanie oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy lub 10 μM ceramidu C16 przywróciło wnikanie cząstek wirusa do komórek traktowanych ambroksolem ( ryc. 5 B).

Ryc.5 . Ambroksol zapobiega aktywacji kwaśnej sfingomielinazy i zakażeniu świeżo wyizolowanych ludzkich komórek nabłonka nosa pikiem pp-VSV-SARS-Cov-2 in vitro . ( A ) Świeżo izolowane ludzkie komórki nabłonka nosa inkubowano z 25 µM ambroksolem przez 1 godzinę lub pozostawiono nieleczone i zakażone pseudowirusowymi cząstkami igły pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 30 minut lub pozostawiono niezainfekowane. Pożywkę usunięto, komórki poddano lizie i określono aktywność kwaśnej sfingomielinazy poprzez spożycie dodanej [ 14 C] sfingomieliny. Podano średnie ± SD aktywności kwaśnej sfingomielinazy z 4 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc . ( B.) Świeżo wyizolowane ludzkie komórki nabłonka nosa inkubowano z 10 µM lub 25 µM ambroksolem przez 1 godzinę i zakażono kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2. Infekcję określono przez zliczenie komórek eGFP dodatnich w co najmniej 500 komórkach / próbkę. Rekonstytucja ceramidu przez zastosowanie 0,2 U / ml oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy lub 10 μM ceramidu C16 (C16-Cer) przywróconego zakażenia ludzkich komórek nabłonka nosa leczonych ambroksolem. Podano średnie ± SD procentu eGFP-dodatnich, tj. Zakażonych komórek, z 4 niezależnych eksperymentów. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc .

Aby zasymulować wpływ ambroksolu na infekcję jak najbliżej leczenia pacjentów, wyizolowaliśmy komórki nabłonka nosa od ochotników. Ochotnicy następnie wdychali 2 ml ambroksolu (7,5 mg / ml) i komórki nabłonka nosa ponownie izolowano z przeciwległej jamy nosowej 60 minut po inhalacji i zaszczepiano kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo przez 60 minut. Komórki przepłukano i określono stopień infekcji po inkubacji przez 24 godziny. Ponadto określiliśmy aktywność kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa przed i po inhalacji ambroksolu. Badania te ujawniły, że wdychanie ambroksolu in vivo znacznie zmniejszyło aktywność kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa ( ryc.ZA). Infekcja pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 30 min spowodowała aktywację kwaśnej sfingomielinazy ( ryc. 6 A) i uwolnienie ceramidu ( ryc. 6 B), zdarzenia, które zostały zablokowane przez wcześniejszą inhalację ambroksolu. Infekcja spowodowała również skupienie się ACE2 w domenach błonowych komórek nabłonka nosa wzbogaconych w ceramidy ( ryc. 6 C). Co najważniejsze, inhalacja ambroksolu zapobiegała przedostawaniu się ostrza pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo do świeżo wyizolowanych komórek nabłonka nosa ( ryc. 6 D). Dodanie ceramidu C16 przywróciło infekcję komórek wyizolowanych od osób, które wdychały ambroksol, z kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 ( ryc. 6 D).

Ryc.6 . Podawanie ambroksolu in vivo zapobiega zakażeniu komórek nabłonka nosa ostrzem pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo. Komórki nabłonka nosa pobrano od ochotników. Ochotnicy następnie wdychali 2 ml ambroksolu, czyli 15 mg ambroksolu. Komórki nabłonka nosa pobrano z przeciwległej jamy nosowej 1 godzinę po inhalacji. Wszystkie komórki natychmiast przemyto po izolacji, a osady komórek ponownie zawieszono w pożywce do hodowli komórek i zakażono szpikulcem pp-VSV-SARS-CoV-2 lub pozostawiono niezainfekowane na 30 minut ( A , B , C ) w celu oznaczenia kwaśnej sfingomielinazy ( A ) , domeny membranowe wzbogacone ceramidami ( B ) i ceramidami z klastrami ACE2 (C ) lub przez 1 godzinę ( D ) w celu określenia infekcji ( D ). ( A ) W celu określenia aktywności kwaśnej sfingomielinazy, osady komórek poddano lizie w 50 mM octanie sodu (pH 5,0) i 0,2% NP40, a aktywność kwaśnej sfingomielinazy oznaczono mierząc zużycie dodanej [ 14 C] sfingomieliny. ( B ) Komórki ekstrahowano organicznie i oznaczano ceramid metodą oznaczenia kinazy ceramidowej. Czarne symbole oznaczają ceramidy C16 / C18, szare symbole ceramidy C22 / C24. ( C.) Świeżo wyizolowane komórki nabłonka nosa zakażano pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 30 min, przemywano, utrwalano w 1% PFA przez 10 min, przemywano i barwiono przeciwciałami anty-ceramidowymi sprzężonymi z Cy3 i FITC-anty-ACE2 . Przedstawiono reprezentatywne wyniki 4 niezależnych eksperymentów. ( D ) Komórki zakażono ostrzem VSV-SARS-CoV-2 przez 1 godzinę, przemyto i po 24 godzinach określono ekspresję eGFP w co najmniej 500 komórkach nabłonka na próbkę w losowo wybranych polach mikroskopowych. Jeśli było to wskazane, ceramid C16 (10 µM) odtwarzano podczas infekcji. Amb = inhalacja ambroksolem. Panele A , B i D pokazują średnie ± odchylenie standardowe od 4 ochotników. *** p <0,001, ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc .

Dyskusja

Niniejsze badania pokazują, że ambroksol zapobiega przedostawaniu się piku pp-VSV-SARS-CoV-2 do hodowanych komórek nabłonka, a także świeżo izolowanych ludzkich komórek nabłonka nosa ex vivo ( ryc. 7 ). Co najważniejsze, inhalacja ambroksolu była wystarczająca, aby zmniejszyć aktywność kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo i zapobiec infekcji pp-VSV-SARS-CoV-2 komórek nabłonka nosa ex vivo . W eksperymentach inhalacyjnych wykorzystano standardowe stężenia ambroksolu, które są również stosowane w leczeniu pacjentów. Stężenia te były wystarczające do zmniejszenia aktywności kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo, jak pokazano tutaj. Zatem stężenia stosowane klinicznie powinny być wystarczające, aby zapobiec zakażeniu pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2. Wdychaliśmy około 20 mM roztwór ambroksolu. Ponieważ 20-25 μM ambroksolu wystarcza do zablokowania zakażenia pp-VSV-SARS-CoV-2, spodziewamy się bardzo szerokiego okna terapeutycznego.

Ryc.7 . Schemat proponowanego hamowania zakażeń kolcem pp-SARS-CoV-2 przez ambroksol. Początkowe wiązanie piku pp-VSV-SARS-CoV-2 powoduje aktywację kwaśnej sfingomielinazy, tworzenie ceramidów powierzchniowych i tworzenie platform membranowych wzbogaconych w ceramidy, które służą do pułapkowania i skupiania aktywowanych receptorów ACE2. Gromadzenie się ACE2 w platformach membranowych wzbogaconych ceramidami może ułatwić przekazywanie sygnałów przez ten receptor, ostatecznie prowadząc do internalizacji, ale także zbliżyć wirusa do proteaz wymaganych do wychwytu.

My i inni wykazaliśmy, że ceramid często sprzyja infekcjom bakteryjnym i wirusowym ( 24 , 25 , 26 , 27 ). Ceramid zmienia błonę plazmatyczną i indukuje tworzenie dużych platform membranowych wzbogaconych ceramidami, które służą do pułapkowania i skupiania cząsteczek receptorów i związanych z nimi sygnałosomów ( 7). W tym miejscu przedstawiamy dowody na to, że skupiska ACE2 w domenach błonowych wzbogaconych w ceramidy po zaszczepieniu komórek pikiem pp-VSV-SARS-CoV-2 potwierdzają pogląd, że ACE2 musi zostać ponownie zorganizowany w te domeny, aby pośredniczyć w zakażeniu. Możliwe jest również, że platformy membranowe wzbogacone ceramidami są wymagane do aktywacji TMPRSS2 i / lub katepsyny L, które pośredniczą w obróbce kolca wymaganego do fuzji z błoną komórkową ( 28 , 29 ).

Zakładamy, że pobieranie cząstek wirusa następuje 20-40 minut po zakażeniu w sposób względnie skoordynowany i że powoduje to stosunkowo krótkotrwałą aktywację kwaśnej sfingomielinazy. Zakładamy również, że ceramid jest szybko zużywany. Bardzo interesujące będzie zdefiniowanie, czy ceramid jest przekształcany w produkt glikozylowany, fosforylowany, przekształcany w sfingozyny, 1-fosforan sfingozyny i heksadecenal, czy nawet używany do ponownego wytwarzania sfingomieliny. Bardzo interesujące będzie również przeprowadzenie szczegółowej lipidomiki po zakażeniu SARS-CoV-2.

Rola układu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidów w zakażeniach wirusowych komórek została wcześniej wykazana w przypadku rinowirusów, wirusa Ebola, odry i japońskiego zapalenia mózgu ( 25 , 30 , 31 , 32 ). Leczenie funkcjonalnymi inhibitorami kwaśnej sfingomielinazy zapobiegało wnikaniu tych wirusów do komórek ( 25 , 30 , 31 , 32 ), co wskazuje na znaczenie układu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidów w infekcji wirusowej. W przeciwieństwie do proinfekcyjnej funkcji ceramidu opisanej powyżej, wykazano, że infekcja grypą, która również skutkuje uwalnianiem ceramidu, chociaż de novoszlak jest hamowany przez ceramid ( 33 ). Ceramid zapobiega replikacji wirusa grypy, co sugeruje, że ceramid odgrywa rolę ochronną i przeciwwirusową. Dalsze badania wykazały, że niedobór genetyczny lub farmakologiczne hamowanie kwaśnej sfingomielinazy nie wpłynęło na zakażenie komórek wirusem grypy ( 34 ), co sugeruje, że różne pule ceramidów pełnią różne funkcje w infekcjach wirusowych.

W przeciwieństwie do ceramidu, który sprzyja infekcji wirusowej SARS-CoV-2, sfingozyna (2-amino-4-trans-oktadekeno-1,3-diol), która jest uwalniana z ceramidu w wyniku działania obojętnych, kwaśnych lub alkalicznych ceramidaz , ostatnio wykazano, że wywierają działanie przeciwwirusowe, albo przez wychwytywanie wirusów w endosomach i tym samym kierując je do lizosomalnej degradacji ( 35 ), albo przez konkurowanie z wiązaniem SARS-CoV-2 do ACE2 ( 23 ).

Wchodzenie SARS-CoV-2 do komórki gospodarza jest inicjowane przez wiązanie się jednostki powierzchniowej S1 wirusowej glikoproteiny wypustek z jej komórkowym receptorem enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2), co skutkuje rozszczepieniem wirusowego białka wypustek pod wpływem aktywności transbłonowej proteaza serynowa 2 (TMPRSS2) lub endosomalna proteaza cysteinowa katepsyna L ( 22 , 28 , 29 ).

Wykazano, że bromoheksyna, strukturalnie bardzo podobna do ambroksolu, hamuje TMPRSS2 ( 36 ), którego aktywność jest niezbędna do zakażenia komórek płuc SARS-CoV-2. Jednak w naszych badaniach zahamowanie wychwytu zostało przywrócone przez dodanie oczyszczonej kwaśnej sfingomielinazy lub egzogennego ceramidu C16, co sugeruje, że ambroksol głównie reguluje wnikanie wirusa przez układ kwaśnej sfingomielinazy / ceramidu.

Funkcjonalnymi inhibitorami kwaśnej sfingomielinazy są zwykle kationowe leki amfifilowe, które dyfundują do lizosomów ze względu na swoje właściwości fizykochemiczne, tj. Wysoką lipofilność i słabą zasadowość ( 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 ). Leki są następnie protonowane, a tym samym uwięzione w lizosomach. Lipofilowy, organiczny układ pierścieniowy FIASMA może wiązać się z błoną lipidową, podczas gdy protonowana trzeciorzędowa amina wypiera kwaśną sfingomielinazę z błon lizosomalnych lub z błony plazmatycznej w kwaśnych subdomenach ( 15 , 16 , 17 , 18 , 1920 , 21 ). Wypieranie enzymu z błon lizosomalnych, w szczególności z pęcherzyków wewnątrz lizosomów, powoduje uwolnienie enzymu do światła lizosomu, gdzie ulega degradacji ( 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 ). Zatem leki te pośrednio hamują aktywność kwaśnej sfingomielinazy.

Nasze dane wskazują na centralną rolę kwaśnej sfingomielinazy i ceramidu w zakażaniu ludzkich komórek kolcem pp-SARS-CoV-2. Zatem każda obróbka zwiększająca stężenie ceramidu, w szczególności ceramidu powierzchniowego, może skutkować zwiększoną infekcją SARS-CoV-2. Ambroksol nie stymulował aktywności kwaśnej ceramidazy w stężeniach, które hamowały kwaśną sfingomielinazę, co potwierdza pogląd, że lek działa specyficznie poprzez blokowanie kwaśnej sfingomielinazy. Jednak obniżenie poziomu ceramidazy kwasowej, na przykład przez infekcje bakteryjne ( 37 ), może skutkować zwiększeniem poziomu ceramidów, a zatem może sprzyjać zakażeniu SARS-CoV-2.

Zakażenie mutantami SARS-CoV-2, które mogą uciec z układu odpornościowego i są obecnie przedmiotem wielkiego zainteresowania, nadal byłoby hamowane przez leczenie ambroksolem, ponieważ wszystkie te mutanty wymagają ACE2 do zakażenia. Aktywacja kwaśnej sfingomielinazy i uwolnienie ceramidu są następstwami interakcji SARS-CoV-2. Zatem celowanie w układ kwaśnej sfingomielinazy / ceramidu może być bardzo interesującym podejściem do zapobiegania infekcji mutantami SARS-CoV-2.

Nasze badanie jest poparte dwoma wcześniej opublikowanymi badaniami. Badanie przeprowadzone przez Bradfute i wsp. wykazali, że ambroksol blokuje zakażenie komórek Vero-E6 SARS-CoV-2 ( 38 ). Badanie przeprowadzone przez Olaleye i wsp. wykazali, że mikromolarne stężenia ambroksolu zapobiegały infekcjom komórkowym SARS-CoV-2 określanym jako cytopatyczny efekt wirusa ( 39 ). Autorzy następnie wykazali, używając rekombinowanych białek domeny wiążącej receptor z kolcem i ACE2, że ambroksol zakłóca wiązanie szpiku SARS-CoV-2 z ludzkim ACE2 in vitro ( 39). Zatem ambroksol może zapobiegać infekcjom SARS-CoV-2 na różnych poziomach, tj. Blokując wiązanie się białka wirusa z jego ludzkim receptorem oraz przez hamowanie układu kwaśnej sfingomielinazy / ceramidów.

W tym przypadku wykryliśmy, że inhalacja ambroksolu była wystarczająca do zmniejszenia kwaśnej sfingomielinazy w komórkach nabłonka nosa in vivo i do zablokowania wniknięcia do tych komórek wywołanego kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 ex vivo . Sugeruje to, że wdychanie ambroksolu może zapobiegać zakażeniu SARS-CoV-2 i jego rozprzestrzenianiu się w nabłonku dróg oddechowych człowieka.

Wcześniej wykazaliśmy, że leki przeciwdepresyjne, takie jak fluoksetyna, amitryptylina i kilka innych leków przeciwdepresyjnych, zapobiegają zakażeniu ludzkich komórek SARS-COV-2 ( 14). Te leki przeciwdepresyjne hamują również kwaśną sfingomielinazę i działają bardzo podobnie do ambroksolu. Jednak leki przeciwdepresyjne należy podawać ogólnoustrojowo, podczas gdy ambroksol może być wdychany i działa tylko na drogi oddechowe. Ambroksol jest bardzo bezpieczny i dobrze tolerowany i zasadniczo można go stosować bez ograniczeń czasowych. Leki przeciwdepresyjne mają różnorodne skutki uboczne (np. Zespół wydłużonego QT), interakcje lekowe (np. Hamowanie CYP2D6) i przeciwwskazania (np. Równoległe stosowanie inhibitorów MAO), z których żadne nie jest istotne w przypadku ambroksolu. Szczególnie dobra tolerancja ambroksolu może uzasadniać niskoprogowe stosowanie ambroksolu, na przykład profilaktycznie u osób z ryzykiem wystąpienia ciężkich zakażeń Covid-19, takich jak osoby starsze, lub po kontakcie z zakażoną osobą lub po pozytywnym wyniku testu na SARS-CoV-2 bez objawów COVID-19. Jednak ambroksol najprawdopodobniej nie jest skuteczny na późniejszych etapach, gdy infekcja wirusowa staje się ogólnoustrojowa.

Ambroksol to bezpieczny lek stosowany klinicznie od 1979 roku, przynajmniej w Niemczech. Nie ma prawie żadnych skutków ubocznych. Ponadto inhalacja jest bardzo bezpieczną metodą leczenia na ogół bardzo często pozwalającą uniknąć ogólnoustrojowych skutków ubocznych. Dlatego nasze dane uzasadniają dalsze badania w celu zbadania, czy ambroksol może być klinicznie stosowany do zapobiegania lub leczenia zakażeń SARS-CoV-2.

Metody

Oświadczenie dotyczące etyki

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Essen pod numerami 19-9033-BO i 276235-BO. Eksperymenty są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

Studia na ludziach

Ludzkie komórki nabłonka nosa uzyskano od 4 zdrowych ochotników, 1 kobiety i 3 mężczyzn (w wieku 48, 54, 54 i 56 lat). Pokazaliśmy już, że zakażenie kolcem pp-SARS-CoV-2 nie różni się między komórkami kobiet i mężczyzn. Wielkość próbki została zaplanowana dla ciągłej zmiennej różnicy wychwytu wirusa i została oparta na dwustronnych testach Wilcoxona-Manna-Whitneya przy użyciu G * Power wersja 3.1.7, Uniwersytet w Duesseldorfie, Niemcy. Komórki nabłonka nosa uzyskano od wszystkich pacjentów przed i po inhalacji ambroksolu, a zatem wszyscy pacjenci zostali włączeni do obu ramion badania (nieleczeni vs. leczeni). Pacjenci wdychali całkowitą ilość 15 mg ambroksolu (7,5 mg / ml) przy użyciu Pariboy®. Ambroksol pochodził z firmy Ratiopharm.

Komórki nabłonka nosa od tych ochotników pobrano bezpośrednio przed i 1 godzinę po inhalacji ambroksolu. Komórki usunięto z błony śluzowej nosa, wkładając małą szczoteczkę do nosa (głębokość około 1,5-2 cm). Szczoteczkę delikatnie obracano w nosie. Komórki nabłonka nosa zostały uwolnione ze szczoteczki i natychmiast zawieszone w 1 ml HEPES / soli fizjologicznej (H / S; 132 mM NaCl, 20 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 0,7 mM MgCl 2 , 0,8 mM MgSO 4 ), granulowany i natychmiast używany do infekcji.

Cząsteczki pseudowirusowe

Pseudotypowane cząsteczki wirusa wygenerowano zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem ( 40 ). Cząsteczki te są oparte na defektywnym replikacji VSV, który koduje eGFP i lucyferazę świetlika zamiast rodzicielskiego VSV-G (VSV * ΔG-FLuc) ( 41 ). HEK-293T transfekowano odpowiednimi konstruktami genów przez 24 godziny przy użyciu metody z fosforanem wapnia w celu przejściowej ekspresji SARS-CoV-2-spike lub VSV-G. Komórki zaszczepiono VSV-G-trans uzupełnione VSV * ΔG-Fluc przez 1 godzinę w temperaturze 37 ° C i 5% CO 2 , inokulum usunięto, komórki przemyto PBS, świeżą pożywkę hodowlaną dodano i komórki inkubowano w temperaturze 37 ° C i 5% cO 2. W komórkach wykazujących ekspresję SARS-CoV-2 pożywkę hodowlaną uzupełniono przeciwciałem anty-VSV-G (I1, supernatant mysiej hybrydomy z American Type Culture Collection [ATCC] CRL-2700) w celu uzyskania inaktywacji resztkowego VSV-G-trans -komplementowany VSV * ΔG-FLuc. Wszystkie supernatanty hodowli zebrano 16 godzin po zaszczepieniu, resztki komórek osadzono przez odwirowanie (4000 xg, 4 ° C, 10 min) i supernatanty zastosowano do eksperymentów. Cząsteczki pseudowirusów zatężono przy użyciu kolumny wirówkowej w celu usunięcia pożywki.

Ogniwa Vero-E6 i Caco-2

Komórki Vero-E6 (ATCC CCL-81; komórki nabłonka nerki małpy) hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle’a Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 10 mM HEPES (pH 7,4; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM nieistotnych aminokwasów, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy cielęcej.

Komórki nabłonka okrężnicy Caco-2 (ATCC® HTB-37 ™) hodowano w MEM uzupełnionym jak powyżej.

Infekcja komórkowa

Ogniwa Vero-E6

Komórki Vero-E6 hodowano do subkonfluencji przez 24 godziny na szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowej płytce przez 24 godziny, przemywano i traktowano 1 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM lub 50 μM ambroksolu przez 1 godzinę przed na zakażenie kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 lub cząstkami pp-VSV-G. Ambroksol (zapas 7,5 mg / ml) rozcieńczono w H / S, a następnie bezpośrednio dodano do komórek. Kontrole (niezainfekowane) próbki potraktowano rozpuszczalnikiem ambroksolu. Pożywkę następnie usunięto, 250 μl supernatantu hodowli komórkowej zawierającego cząstki pp-VSV-SARS-CoV-2 lub pp-VSV-G i, jeśli wskazano, dodano ambroksol w poprzednim stężeniu, komórki inkubowano przez 24 godziny , przemyto raz w H / S, utrwalono w 1% paraformaldehydzie (PFA) zbuforowanym PBS (pH 7,3) przez 10 min, przemyto, zatopiono w Mowiolu, i analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS-SL wyposażonego w soczewkę 40x i oprogramowanie Leica LCS w wersji 2.61. Policzyliśmy komórki eGFP-dodatnie w co najmniej 500 komórkach na próbkę w losowo wybranych polach mikroskopowych.

Komórki nabłonka nosa

Komórki nabłonka nosa uzyskano od nieleczonych ochotników lub ochotników, którzy wdychali ambroksol, ponownie zawieszono w H / S, podzielono na porcje i osadzono przez wirowanie przy 2800 obr./min przez 8 minut w wirówce Eppendorf (1710 g). Następnie komórki ponownie zawieszono w MEM uzupełnionym 10 mM HEPES (pH 7,4; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM nieistotnych aminokwasów, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy cielęcej, traktowanej ambroksolem przez 1 godzinę lub pozostawionej bez leczenia, osadzonej w osadzie i zakażonej cząstkami kolczastymi pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 60 min. Komórki pacjentów przed lub po inhalacji ambroksolu były natychmiast zakażane przez 1 godzinę pikiem pp-SARS-CoV-2. Komórki następnie przemyto i dalej inkubowano przez 24 godziny, aby umożliwić ekspresję eGFP.

Podwielokrotności komórek nabłonka nosa natychmiast zamrażano szokowo w ciekłym azocie po usunięciu w celu określenia aktywności kwaśnej sfingomielinazy lub stężenia ceramidów (patrz poniżej).

Wiązanie FITC-Annexin V.

Komórki Vero inkubowano przez 24 godziny z 25 μM ambroksolu w MEM uzupełnionym jak powyżej, przemyto, poddano działaniu trypsyny, przemyto w H / S i barwiono przez 15 minut FITC-Annexin V (Roche) zgodnie z instrukcjami sprzedawcy i analizowano przez cytometria przepływowa z BD Calibur. Kontrole permeabilizowano przez 5 minut 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przed inkubacją z FITC-Annexin V.

Aktywność kwaśnej sfingomielinazy

Vero-E6 lub komórki nabłonka nosa pozostawiono nietraktowane lub wstępnie potraktowane ambroksolem przez 1 godzinę, przemyto raz w H / S, a osady natychmiast zamrożono szokowo lub ponownie zawieszono i zakażono 250 μl supernatantu hodowli komórkowej zawierającego pp-VSV-SARS-CoV -2 skoki przez 10 min, 20 min, 30 min lub 45 min. Nietraktowane komórki kontrolne inkubowano z DMEM lub MEM uzupełnionym jak powyżej. Supernatanty usunięto, próbki zamrożono szokowo, rozmrożono i natychmiast poddano lizie w 250 mM octanie sodu (pH 5,0) i 1% NP40 przez 5 min. Lizaty rozcieńczono do 0,2% NP40 w 250 mM octanie sodu (pH 5,0) i dodano 0,05 µCi [ 14 C] sfingomieliny (52 mCi / mmol; Perkin Elmer, #NEC 663010UC) na próbkę. Podłoże [ 14C] sfingomielinę suszono przez 10 minut w SpeedVac, ponownie zawieszano w 250 mM octanie sodu (pH 5,0) i 0,1% NP40 i sonikowano przez 10 minut w łaźni sonikacyjnej przed dodaniem do próbek. Próbki inkubowano przez 30 min w 37 ° C z wytrząsaniem przy 300 obr./min. Następnie próbki ekstrahowano organicznie w 4 objętościach CHCl 3 : CH 3 OH (2: 1, v / v), worteksowano, próbki odwirowano, a podwielokrotność górnej fazy wodnej zliczono scyntylacyjnie w celu określenia uwalniania [ 14 C] fosforylocholina z [ 14 C] sfingomieliny.

Pomiar ceramidu

Komórki traktowano ambroksolem przez 1 godzinę lub nie traktowano jak powyżej, pożywkę usunięto, komórki poddano lizie w 200 μl H 2 O i lizaty ekstrahowano w CHCl 3 : CH 3OH: 1N HC1 (100: 100: 1, v / v / v). Fazy ​​rozdzielono przez 5 min wirowania próbek przy 14 000 obr / min. Dolną fazę zebrano, wysuszono i ponownie zawieszono w 20 µl roztworu detergentu (7,5% [w / v] n-oktyloglukopiranozyd, 5 mM kardiolipiny w 1 mM kwasie dietylenotriaminopentaoctowym [DTPA]). Micele uzyskano przez sonikację w kąpieli przez 10 minut i zastosowano do reakcji kinazy, którą zainicjowano przez dodanie 70 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 μl kinazy diacyloglicerolowej (DAG) (GE Healthcare Europe, Monachium, Niemcy), 0,1 M imidazol / HCl (pH 6,6), 0,2 mM DTPA (pH 6,6), 70 mM NaCl, 17 mM MgCl 2 , 1,4 mM kwas etylenoglikolotetraoctowy, 2 mM ditiotreitolu, 1 uM trifosforanu adenozyny (ATP) i 5 jiCi [ 32P] γATP (6000 Ci / mmol; Hartmann Radiochemicals, Braunschweig, Niemcy). Reakcję kinazy prowadzono przez 60 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem 300 obrotów na minutę. Próbki poddano ekstrakcji organicznej w 1 ml CHCI 3 : CH 3 OH: 1 N HCI (100: 100: 1, v / v / v), 170 ul buforowany roztwór soli (135 mM NaCl, 1,5 mM CaCl 2 , 0,5 mM MgCl 2 , 5,6 mM glukozy, 10 mM HEPES [pH 7,2]) i 30 µl 100 mM roztworu EDTA i rozdzielono fazy. Dolną warstwę zebrano, wysuszono w SpeedVac, rozdzielać na krzemionce G60 chromatografii cienkowarstwowej (TLC) płyty chloroform / aceton / metanol / kwas octowy / H 2O (50: 20: 15: 10: 5, v / v / v / v / v) i opracowane za pomocą fosfoimagera Fuji. Ilości ceramidów określono przez porównanie z krzywą wzorcową przy użyciu ceramidów C16 do C24 jako substratów.

Rekonstytucja ceramidu

Komórki traktowano 25 μM ambroksolem przez 1 godzinę i zakażano kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 w obecności lub przy braku 10 μM ceramidu C16 (Avanti Polar Lipids; # 860516) lub 0,2 U / ml rekombinowanej kwaśnej sfingomielinazy ( aktywność właściwa: 1700 pmol / min / μg; R&D, # 5348-PD-010). Ceramid C16 ponownie zawieszono w pożywce do hodowli komórek i sonikowano przez 10 minut w łaźni sonikatora przed użyciem. Następnie określiliśmy wychwyt wirusa jak powyżej.

Leczenie sfingomieliną

Sfingomielinę zawieszono przy 10 mM w 10% oktyloglukopiranozydzie, rozcieńczono w DMEM / 10% FCS do 50 µM, sonikowano przez 10 minut i dodawano do komórek na 60 minut przed jakąkolwiek infekcją. Podczas infekcji stężenie sfingomieliny utrzymywało się na poziomie 50 µM. Wychwyt sfingomieliny kontrolowano przez dodanie 0,05 µCi [ 14 C] sfingomieliny, która została przygotowana jak powyżej. Komórki intensywnie przemywano po 60 minutach inkubacji i określano wychwyt [ 14 C] sfingomieliny za pomocą ciekłego zliczania scyntylacji lizatów komórkowych.

Genetyczna regulacja w dół kwaśnej sfingomielinazy

Ekspresja kwaśnej sfingomielinazy w komórkach Caco-2 była regulowana w dół przez przejściową transfekcję komercyjnym shRNA ukierunkowanym na kwaśną sfingomielinazę (Santa Cruz Inc .; # sc-41650) z zastosowaniem elektroporacji przy 400 V z 5 impulsami, 3 ms każdy, z elektroporatorem BTX. Kontrole transfekowano nieistotnym shRNA (Santa Cruz Inc., # sc-108060). Martwe komórki usunięto po 24 godzinach, a komórki hodowano przez dodatkowe 24 godziny przed zakażeniem kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2. Zmniejszenie aktywności kwaśnej sfingomielinazy potwierdzono mierząc aktywność enzymu w komórkach transfekowanych, transfekowanych kontrolnie i nietransfekowanych.

Mikroskopia konfokalna ceramidu i ACE2

Komórki Vero-E6 hodowano przez noc na szklanych szkiełkach nakrywkowych, traktowano 25 μM ambroksolu przez 1 godzinę jak powyżej lub pozostawiono bez leczenia i zakażono igłą pp-VSV-SARS-CoV-2 lub w obecności lub nieobecności 25 μM ambroksolu przez 60 min lub pozostawiony niezainfekowany. Komórki przemyto raz solanką buforowaną fosforanem (PBS) (pH 7,4) i utrwalano przez 10 minut w 1% PFA zbuforowanym w PBS. Świeżo wyizolowane komórki nabłonka nosa zakażono kolcem pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 30 minut, przemyto i utrwalono przez 10 minut w 1% PFA buforowanym w PBS. Komórki następnie przemyto dwukrotnie w PBS, zablokowano przez inkubację przez 15 minut w H / S + 5% FCS, przemyto raz i wybarwiono przeciwciałami anty-ceramidowymi (1: 200, klon S58-9) w H / S z 1 % FCS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto trzykrotnie w PBS z dodatkiem 0,05% Tween 20. Próbki następnie inkubowano z kozimi przeciwciałami anty-ACE2 (1: 500; R&D # AF 933) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Próbki ponownie przemyto i kolejno wybarwiono FITC-anti-goat F (ab)2 fragmenty i fragmenty Cy3-anty-mysie IgM F (ab) 2 . Próbki myto pomiędzy i po barwieniu i ostatecznie zatopiono w Mowiolu. Barwienie kontrolne przeprowadzono z nieistotnymi IgM i kozimi IgG i nie wykazało dodatniego barwienia. Uwzględniliśmy również kontrole tylko z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z Cy3 lub FITC.

Próbki analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica TCS-SP5 wyposażonego w soczewkę 40x i oprogramowanie Leica LCS w wersji 2.61. Wszystkie próbki z tej samej serii zostały zmierzone przy identycznych ustawieniach.

Neutralizacja ceramidów

Ceramid zneutralizowano w komórkach Vero-E6 przez dodanie 50 μg / ml klonu anty-ceramidowego przeciwciała IgM S85-9 (Glycobiotech; MAB_0014) lub 100 μg / ml mysiego monoklonalnego anty-ceramidowego IgG (Antibody Res. Corp. .; # 111583) lub 0,2 jednostki / ml obojętnej ceramidazy (R&D, # 3557 AH) do komórek. Komórki inkubowano przez 10 min, a następnie zakażono cząstkami kolców pp-VSV-SARS-CoV-2 przez 60 min. Kontrole inkubowano z nieistotnymi przeciwciałami IgM lub IgG (Dako). Komórki następnie przemyto, hodowano przez 24 godziny i analizowano pod kątem infekcji jak powyżej.

Kwaśna aktywność ceramidazy

Komórki Vero-E6 traktowano 25 μM ambroksolem lub pozostawiano nietraktowane i lizowano w 1% Nonidet P40 (NP40) w 150 mM octanie sodu (pH 4,5) przez 5 minut na lodzie, rozcieńczano do 0,1% NP40 w 150 mM octanie sodu (pH 4,5) i 0,3 μCi / próbkę [ 14 C 16 ] ceramidu (ARC0831, 55 mCi / mmol). Podłoże [ 14 C 16 ] ceramid suszono przez 10 minut, ponownie zawieszano w 0,1% OGP w 150 mM octanie sodu (pH 4,5) i łaźnię sonikowaną przez 10 minut przed dodaniem do próbek. Próbki inkubowano w 37 o C przez 60 min. Reakcję zakończono przez ekstrakcję H 2 O i CHCI 3 : CH 3OH: HCl (100: 100: 1, v / v / v). Faza dolna wysuszono i próbki zawieszano w CHCI 3 : CH 3 OH (1: 1, v / v), oddzielone przez TLC z CHCI 3 : CH 3 OH: NH 4 OH (90: 20: 0,5, v / v / v) i przeanalizowano za pomocą Fuji Imager.

Pomiary sfingozyny

Komórki Vero E6 potraktowano 25 uM ambroksol przez 60 min, pożywkę usuwa się, komórki zdrapano z płytki w 200 ul H 2 O i ekstrahowano w 800 ul CHCI 3 : CH 3 OH: 1 N HCI (100: 200: 1, v / v / v). Dolną fazę wysuszono i ponownie zawieszono w roztworze detergentu (7,5% [wag./obj.] N-oktyloglukopiranozyd, 5 mM kardiolipiny w 1 mM kwasie dietylenotriaminopentaoctowym [DTPA]). Reakcję kinazy prowadzono przez dodanie kinazy sfingozyny 0,001 jednostki w 50 mM HEPES (pH 7,4), 250 mM NaCl, 30 mM MgCI 2 1 mM ATP i 10 jiCi [ 32 P] γATP. Próbki inkubowano przez 60 min w 37 o C z wytrząsaniem (350 obr / min). Reakcję zakończono przez dodanie 100 yl H 2O, 20 | jl 1 N HCl, 800 ul CHCI 3 : CH 3 OH: 1 N HCI (100: 200: 1, v / v / v) i 240 | il każdego z CHCI 3 i 2M KCI. Próbki worteksowano, oddzielono fazy, dolną fazę zebrano, wysuszono, rozpuszczono w 20 μl CHCl 3 : CH 3 OH (1: 1, v / v) i rozdzielono na płytkach Silica G60 TLC z CHCl 3 : CH 3 OH : kwas octowy: H 2 O (90: 90: 15: 5 v / v / v / v) jako rozpuszczalnik rozwijający. Płytki TLC analizowano za pomocą aparatu Phosphorimager. Poziomy sfingozyny określono za pomocą standardowej krzywej C18-sfingozyny.

Analiza statystyczna

Dane wyrażono jako średnie arytmetyczne ± SD. Do porównania zmiennych ciągłych z grup niezależnych zastosowaliśmy jednoczynnikową ANOVA, a następnie testy t Studenta post hoc dla wszystkich porównań parami oraz poprawkę Bonferroniego dla testów wielokrotnych. Wartości p dla porównań parami obliczono po korekcie Bonferroniego. Wszystkie wartości miały rozkład normalny. Istotność statystyczną ustalono na poziomie p ≤ 0,05 (dwustronne). Planowanie wielkości próbki dla eksperymentów in vivo zmiennych ciągłych oparto na dwustronnych testach Wilcoxona-Manna-Whitneya (bezpłatne oprogramowanie: G * Power wersja 3.1.7, Uniwersytet w Duesseldorfie, Niemcy). We wszystkich eksperymentach mikroskopowych badacze byli zaślepieni na tożsamość próbek.

Oświadczenia o dostępności danych

Wszystkie dane są dostępne na życzenie autorów. Autorzy potwierdzają, że wszystkie dane są zawarte w manuskrypcie.

Deklaracja interesów

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowanie

Badanie było wspierane przez granty DFG Gu-335-35 / 1 i Gu-335-38 / 1 dla EG oraz granty BMBF dla SP (RAPID Consortium, 01KI1723D i 01KI2006D; RENACO, 01KI20328A, 01KI20396).

Bibliografia

https://covid-19-nieznane-fakty.pl/zapobieganie/covid-19-uklad-odpornosciowy-zapewnia-trwala-obrone-po-wyzdrowieniu/

Covid-19 – Wodór molekularny może także pomóc w walce z długim Covid i rehabilitacji.

Suplementacja cynkiem zwiększa skuteczność chlorochiny / hydroksychlorochiny, aby wygrać walkę z COVID-19

Wymazy z nosa COVID związane ze zwiększonym ryzykiem zapalenia opon mózgowych

Badanie Stanforda opublikowane po cichu na NIH.gov dowodzi, że maski są absolutnie bezwartościowe w stosunku do Covid